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Reversible inactivation of dihydrolipoamide dehydrogenase by mitochondrial hydrogen peroxide.

Published date 2012 Dec 12

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Reversible inactivation of dihydrolipoamide dehydrogenase by mitochondrial hydrogen peroxide.

ミトコンドリア過酸化水素によるジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼの可逆不活性化。

Published date

2012-12-12

Author

Liang-Jun Yan, Nathalie Sumien, Nopporn Thangthaeng, Michael J Forster

Affiliation

Department of Pharmacology and Neuroscience and Institute for Aging and Alzheimer's Disease Research, University of North Texas Health Science Center , Fort Worth, TX , USA.

Abstract

Abstract Under oxidative stress conditions, mitochondria are the major site for cellular production of reactive oxygen species (ROS) such as superoxide anion and H(2)O(2) that can attack numerous mitochondrial proteins including dihydrolipoamide dehydrogenase (DLDH). While DLDH is known to be vulnerable to oxidative inactivation, the mechanisms have not been clearly elucidated. The present study was therefore designed to investigate the mechanisms of DLDH oxidative inactivation by mitochondrial reactive oxygen species (ROS). Mitochondria, isolated from rat brain, were incubated with mitochondrial respiratory substrates such as pyruvate/malate or succinate in the presence of electron transport chain inhibitors such as rotenone or antimycin A. This is followed by enzyme activity assay and gel-based proteomic analysis. The present study also examined whether ROS-induced DLDH oxidative inactivation could be reversed by reducing reagents such as DTT, cysteine, and glutathione. Results show that DLDH could only be inactivated by complex III- but not complex I-derived ROS; and the accompanying loss of activity due to the inactivation could be restored by cysteine and glutathione, indicating that DLDH oxidative inactivation by complex III-derived ROS was a reversible process. Further studies using catalase indicate that it was H(2)O(2) instead of superoxide anion that was responsible for DLDH inactivation. Moreover, using sulfenic acid-specific labeling techniques in conjunction with two-dimensional Western blot analysis, we show that protein sulfenic acid formation (also known as sulfenation) was associated with the loss of DLDH enzymatic activity observed under our experimental conditions. Additionally, such oxidative modification was shown to be associated with preventing DLDH from further inactivation by the thiol-reactive reagent N-ethylmaleimide. Taken together, the present study provides insights into the mechanisms of DLDH oxidative inactivation by mitochondrial H(2)O(2).

 

要約Under酸化ストレスは規定する、ミトコンドリアは活性酸素種(ROS)(例えばスーパーオキサイドアニオンとジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ(DLDH)を含む多数のミトコンドリア・タンパク質を攻撃することができるH(2)O(2))の細胞性産生のための主要部位である。
DLDHが酸化性不活性化に弱いことを知られる間、機序ははっきり説明されなかった。
従って、本研究はミトコンドリア活性酸素種(ROS)によってDLDH酸化性不活性化の機序を調査するようになっていた。
ミトコンドリア(ラット脳から分離される)はロテノンのような電子伝達系抑制薬の面前でピルビン酸/リンゴ酸塩またはコハク酸塩のようなミトコンドリア呼吸基質で暖められた、または、アンチマイシンA. Thisの後に酵素活性分析とゲル・ベースのプロテオマイク分析法が続く。
本研究も、ROSによって誘発されたDLDH酸化性不活性化が被験者(例えばDTT、システインとグルタチオン)を低下させることによって逆転することができるかどうか調べた。
成績は、DLDHが複雑なI-derivedされたROSでなく複雑なIII-によって不活性化されることができるだけだったことを示す;そして、不活性化による活性の付随的な喪失はシステインとグルタチオンによって回復することができた。
そして、複雑なIIIから派生したROSによるDLDH酸化性不活性化が可逆過程であったことを示した。
カタラーゼを使用している更なる研究は、それがDLDH不活性化の原因となったスーパーオキサイドアニオンの代わりにH(2)O(2)であったことを示す。
そのうえ、二次元のウェスタンブロット解析に関連してsulfenic酸に特有の標識技術を使用して、我々は、タンパク質sulfenic酸構造(別名硫黄隆起成長)が我々の実験的な条件の下で観察されるDLDH酵素活性の喪失と関係していたことを示す。
その上、そのような酸化性変形は、チオール反応性被験者N‐エチルマレイミドによってDLDHに対して更なる不活性化を妨げることと関係していることが示された。
まとめると、本研究はミトコンドリアH(2)O(2)によって、DLDH酸化性不活性化の機序に対する洞察を提供する。


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