Physostigmine and galanthamine bind in the presence of agonist at the canonical and noncanonical subunit interfaces of a nicotinic acetylcholine receptor.
フィソスチグミンとガランタミンは、ニコチン・アセチルコリン受容体の標準的および非正規サブユニット・インタフェースで、作動筋の面前で結合する。
Department of Neurobiology and PhD Program in Neuroscience, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115.
Abstract
Galanthamine and physostigmine are clinically used cholinomimetics that both inhibit acetylcholinesterase and also interact directly with and potentiate nAChRs. As with most nAChR-positive allosteric modulators, the location and number of their binding site(s) within nAChRs are unknown. In this study, we use the intrinsic photoreactivities of [(3)H]physostigmine and [(3)H]galanthamine upon irradiation at 312 nm to directly identify amino acids contributing to their binding sites in the Torpedo californica nAChR. Protein sequencing of fragments isolated from proteolytic digests of [(3)H]physostigmine- or [(3)H]galanthamine-photolabeled nAChR establish that, in the presence of agonist (carbamylcholine), both drugs photolabeled amino acids on the complementary (non-α) surface of the transmitter binding sites (γTyr-111/γTyr-117/δTyr172). They also photolabeled δTyr-212 at the δ-β subunit interface and γTyr-105 in the vestibule of the ion channel, with photolabeling of both residues enhanced in the presence of agonist. Furthermore, [(3)H]physostigmine photolabeling of γTyr-111, γTyr-117, δTyr-212, and γTyr-105 was inhibited in the presence of nonradioactive galanthamine. The locations of the photolabeled amino acids in the nAChR structure and the results of computational docking studies provide evidence that, in the presence of agonist, physostigmine and galanthamine bind to at least three distinct sites in the nAChR extracellular domain: at the α-γ interface (1) in the entry to the transmitter binding site and (2) in the vestibule of the ion channel near the level of the transmitter binding site, and at the δ-β interface (3) in a location equivalent to the benzodiazepine binding site in GABA(A) receptors.
大部分のnAChR陽性アロステリックモジュレーターと同様に、nAChRsの中のそれらの結合部位の位置と数は、知られていない。
この研究において、我々は、直接、Torpedo californica nAChRでそれらの結合部位に貢献しているアミノ酸を特定するために、312ナノメートルで照射に応じて［(3)H］フィソスチグミンと［(3)H］ガランタミンの内因的なフォト反応性を使用する。
作動筋（カルバミルコリン）（伝達物質結合部位（γTyr-111/γTyr-117/δTyr172）の補完的な（非α）表面の上の両方の薬写真のラベルが付いたアミノ酸）が認められる場合、［(3)H］フィソスチグミン-のタンパク質分解ダイジェストから分離される断片のタンパク質塩基配列決定法または［(3)H］ガランタミン-写真のラベルが付いたnAChRはそれを確立する。
彼らもδ-βサブユニット・インタフェースの写真のラベルが付いたδTyr-212とイオンチャネルの前庭のγTyr-105（アゴニストの面前で強化される両方の残りの光標識による）。
さらにまた、γTyr-111、γTyr-117、δTyr-212とγTyr-105の［(3)H］フィソスチグミン光標識は、非放射性ガランタミンが認められる場合、阻害された。
nAChR構造の写真のラベルが付いたアミノ酸の位置と計算ドッキング学科の結果は、作動筋が認められる場合、フィソスチグミンとガランタミンがnAChR細胞外領域で少なくとも3つの異なった部位と結合するという証拠を提供する：α-γインタフェース(1)伝達物質結合部位への入場でと(2)伝達物質結合部位のレベルの近くの、そして、δ-βインタフェースのイオンチャネルの前庭で(3) GABA(A)受容体のベンゾジアゼピン結合部位に等しい位置でで。
