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What is beyond a qRT-PCR study on mesenchymal stem cell differentiation properties: how to choose the most reliable housekeeping genes.

間充織幹細胞微分のプロパティのqRT-PCR研究を越えてあること:最も信頼性が高いハウスキーピング遺伝子を選択する方法。

Published date

2013-1-11

Author

Enrico Ragni, Mariele Viganò, Paolo Rebulla, Rosaria Giordano, Lorenza Lazzari

Affiliation

Cell Factory "Franco Calori", Center for Transfusion Medicine, Cellular Therapy and Cryobiology, Department of Regenerative Medicine, Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Milano, Italy.

Abstract

In the last years, mesenchymal stem cells (MSCs) have been identified as an attractive cell population in regenerative medicine. In view of future therapeutic applications, the study of specific differentiation-related gene expression is a pivotal prerequisite to define the most appropriate MSC source for clinical translation. In this context, it is crucial to use stable housekeeping genes (HGs) for normalization of qRT-PCR to obtain validated and comparable results. By our knowledge, an exhaustive validation study of HGs comparing MSCs from different sources under various differentiation conditions is still missing. In this pivotal study, we compared the expression levels of 12 genes (ACTB, Β2M, EF1alpha, GAPDH, GUSB, PPIA, RPL13A, RPLP0, TBP, UBC, YWHAZ and 18S rRNA) to assess their suitability as HGs in MSCs during adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation. We demonstrated that many of the most popular HGs including 18S rRNA, B2M and ACTB were inadequate for normalization, whereas TBP/YWHAZ/GUSB were frequently identified among the best performers. Moreover, we showed the dramatic effects of suboptimal HGs choice on the quantification of cell differentiation markers, thus interfering with a reliable comparison of the lineage potential properties among various MSCs. Thus, in the emerging field of regenerative medicine, the identification of the most appropriate MSC source and cell line is so crucial for the treatment of patients that being inaccurate in the first step of the stem cell characterization can bring important consequences for the patients and for the promising potential of stem cell therapy.

 

最後の年には、間葉系幹細胞(MSCs)は再生医療の魅力的な細胞集団と特定された。
将来の治療的なアプリケーションからみれば、特定の分化関連の遺伝子発現の本研究は、臨床翻訳のために最適なMSC関係者を定義する重要な必要条件である。
この文脈において、確認されたおよび相当する結果を得るためにqRT-PCRの正常化のために安定ハウスキーピング遺伝子(HGs)を使用することは、十字形である。
我々の知識によって、さまざまな分化条件の下で異なるソースからMSCsを比較しているHGsの徹底的な確証検査は、まだ失われている。
この重要な検査において、我々は、脂肪生成、骨形成および軟骨形成の分化の間のMSCsのHGsとしてそれらの適合性を評価するために、12の遺伝子(ACTB、Β2M、EF1alpha、GAPDH、GUSB、PPIA、RPL13A、RPLP0、TBP、UBC、YWHAZと18SリボソームRNA)の発現レベルを比較した。
我々は18SリボソームRNA、B2MとACTBを含む最も人気のあるHGsの多数が正常化に不十分なことを証明したが、TBP/YWHAZ/GUSBは最善のパフォーマーの間でしばしば確認された。
さらに、我々は最適以下のHGs選択の劇的な効果を細胞分化標識の定量化に関して示した。
このように、さまざまなMSCsの間で血統可能性特性の信頼性が高い比較を邪魔した。
このように、再生医療の新生の分野では、最適なMSC関係者と細胞系の同定は、幹細胞特徴描写の第一段階で不正確であることが患者のために、そして、基部細胞療法の有望な可能性のために重要な結果をもたらすことができるように、患者の治療のために十字形である。


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