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Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.

標準相加定量的リアルタイムPCR(SAQPCR):PCR効率評価を回避している導入遺伝子コピー数の測定のための新しいアプローチ。

Published date

2013-01-07

Author

Yuji Huang, Xueren Yin, Changqing Zhu, Weiwei Wang, Donald Grierson, Changjie Xu, Kunsong Chen

Affiliation

Laboratory of Fruit Quality Biology, Zhejiang University, Hangzhou, PR China.

Abstract

Quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) has been previously applied to estimate transgene copy number in transgenic plants. However, the results can be erroneous owing to inaccurate estimation of PCR efficiency. Here, a novel qPCR approach, named standard addition qPCR (SAQPCR), was devised to accurately determine transgene copy number without the necessity of obtaining PCR efficiency data. The procedures and the mathematical basis for the approach are described. A recombinant plasmid harboring both the internal reference gene and the integrated target gene was constructed to serve as the standard DNA. It was found that addition of suitable amounts of standard DNA to test samples did not affect PCR efficiency, and the guidance for selection of suitable cycle numbers for analysis was established. Samples from six individual T(0) tomato (Solanum lycopersicum) plants were analyzed by SAQPCR, and the results confirmed by Southern blot analysis. The approach produced accurate results and required only small amounts of plant tissue. It can be generally applied to analysis of different plants and transgenes. In addition, it can also be applied to zygosity analysis.

 

定量的リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)は、遺伝子導入植物で導入遺伝子コピー数を推定するために、以前適用された。
しかしながら、結果はPCR効率の不正確な評価のために誤りでありえる。
ここでは、新しいqPCRアプローチ(標準相加qPCR(SAQPCR)という名の)は、PCR効率データを得る必要性なしで正確に導入遺伝子コピー数を測定するために考案された。
処置とアプローチの数学的根拠は、述べられる。
体内の参照遺伝子と統合した標的遺伝子を収容している組換えプラスミドは、標準DNAとして役に立つために造られた。
検体を検査する適切な量の標準DNAの追加がPCR効率に影響を及ぼさないことが判明した、そして、分析のための適切なサイクル番号の選択のためのガイダンスは行われた。
個々の6T (0)のトマト(トマト)植物からの検体はSAQPCRによって分析された、そして、結果がサザンブロット解析によって確認された。
アプローチは正確な結果をもたらして、植物組織の少量だけを必要とした。
それは、通常、異なる植物と導入遺伝子の分析に適用されることができる。
加えて、それは接合子性分析に適用されることもできる。


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