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Identification of cell-specific patterns of reference gene stability in quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction studies of embryonic, placental and neural stem models of prenatal ethanol exposure.

定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応の参照遺伝子安定性の細胞に特有のパターンの同定は、出生前のエタノール暴露の胎仔の、胎盤および神経基部モデルの研究する。

Published date

2013-1-11

Author

Mindy N Carnahan, Kylee J Veazey, Daria Muller, Joseph D Tingling, Rajesh C Miranda, Michael C Golding

Affiliation

College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University, College Station, TX 77843, USA.

Abstract

Identification of the transcriptional networks disrupted by prenatal ethanol exposure remains a core requirement to better understanding the molecular mechanisms of alcohol-induced teratogenesis. In this regard, quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (qPCR) has emerged as an essential technique in our efforts to characterize alterations in gene expression brought on by exposure to alcohol. However, many publications continue to report the utilization of inappropriate methods of qPCR normalization, and for many in vitro models, no consistent set of empirically tested normalization controls have been identified. In the present study, we sought to identify a group of candidate reference genes for use within studies of alcohol exposed embryonic, placental, and neurosphere stem cells under both conditions maintaining stemness as well as throughout in vitro differentiation. To this end, we surveyed the recent literature and compiled a short list of fourteen candidate genes commonly used as normalization controls in qPCR studies of gene expression. This list included: Actb, B2m, Gapdh, Gusb, H2afz, Hk2, Hmbs, Hprt, Mrpl1, Pgk1, Ppia, Sdha, Tbp, and Ywhaz. From these studies, we find no single candidate gene was consistently refractory to the influence of alcohol nor completely stable throughout in vitro differentiation. Accordingly, we propose normalizing qPCR measurements to the geometric mean C(T) values obtained for three independent reference mRNAs as a reliable method to accurately interpret qPCR data and assess alterations in gene expression within alcohol treated cultures. Highlighting the importance of careful and empirical reference gene selection, the commonly used reference gene Actb was often amongst the least stable candidate genes tested. In fact, it would not serve as a valid normalization control in many cases. Data presented here will aid in the design of future experiments using stem cells to study the transcriptional processes driving differentiation, and model the developmental impact of teratogens.

 

出生前のエタノール暴露によって破綻する転写ネットワークの同定は、アルコールによって誘発された奇形発生の分子機構をよりよく理解することへの中心的な要求のままである。
この点に関しては、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)は、アルコールへの暴露によってもたらされる遺伝子発現で変更を特徴づける我々の努力の基本的技術として現れた。
しかしながら、多くの刊行物はqPCR正常化の不適当な方法の利用を報告し続ける、そして、多くの生体外モデルのために、対照がそうであった経験的に検査された正常化の一貫したセットは同一化しなかった。
本研究において、我々は胎性で、胎盤で露出するアルコールの研究の範囲内で使用のために一群の候補参照遺伝子を特定しようとした、そして、両方の条件の下の神経球体幹細胞が全体に生体外分化と同様にstemnessを維持した。
この目的で、我々は最近の文献を調査して、遺伝子発現のqPCR研究の正常化対照として一般に使われる14の候補遺伝子のショートリストを編集した。
このリストは以下を含んだ:Actb、B2m、Gapdh、Gusb、H2afz、Hk2、Hmbs、Hprt、Mrpl1、Pgk1、Ppia、Sdha、TbpとYwhaz。
本研究から、我々は、一つの候補遺伝子も一貫してアルコールの影響も困難でなかったし、生体外分化の全体を通じても完全に安定でなかったとわかる。
したがって、我々は、値が信頼性が高い方法としての3つの独立参照mRNAが正確にqPCRデータを解釈して、アルコール処理培養の範囲内で遺伝子発現で変更を評価するために得た幾何平均C(T)にqPCR測定を正常化しようと提案する。
慎重および経験的参照遺伝子選択の重要性を強調して、一般的に用いられる参照遺伝子Actbは、しばしば、検査される最も少なく安定候補遺伝子の間にあった。
実際に、それは多くの場合有効な正常化制御として用いられない。
ここで提示されるデータは、分化をドライブしている転写プロセスを研究するために幹細胞を使用している将来の実験の設計を手伝って、テラトゲンの発達上の衝撃をモデル化する。


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