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The use of spin desalting columns in DMSO-quenched H/D-exchange NMR experiments.

Published date 2013 Feb 11

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The use of spin desalting columns in DMSO-quenched H/D-exchange NMR experiments.

DMSOを急冷されたH/D-交換NMRで柱を脱塩している回転の使用は、実験する。

Published date

2013-02-11

Author

Mahesh S Chandak, Takashi Nakamura, Toshio Takenaka, Tapan K Chaudhuri, Maho Yagi-Utsumi, Jin Chen, Koichi Kato, Kunihiro Kuwajima

Affiliation

Okazaki Institute for Integrative Bioscience and Institute for Molecular Science, National Institutes of Natural Sciences, 5-1 Higashiyama, Myodaiji, Okazaki, Aichi 444-8787, Japan; Department of Functional Molecular Science, School of Physical Sciences, Graduate University for Advanced Studies (Sokendai), 5-1 Higashiyama, Myodaiji, Okazaki, Aichi 444-8787, Japan.

Abstract

Dimethylsulfoxide (DMSO)-quenched hydrogen/deuterium (H/D)-exchange is a powerful method to characterize the H/D-exchange behaviors of proteins and protein assemblies, and it is potentially useful for investigating non-protected fast-exchanging amide protons in the unfolded state. However, the method has not been used for studies on fully unfolded proteins in a concentrated denaturant or protein solutions at high salt concentrations. In all of the current DMSO-quenched H/D-exchange studies of proteins so far reported, lyophilization was used to remove D2 O from the protein solution, and the lyophilized protein was dissolved in the DMSO solution to quench the H/D exchange reactions and to measure the amide proton signals by two-dimensional nuclear magnetic resonance (2D NMR) spectra. The denaturants or salts remaining after lyophilization thus prevent the measurement of good NMR spectra. In this article, we report that the use of spin desalting columns is a very effective alternative to lyophilization for the medium exchange from the D2 O buffer to the DMSO solution. We show that the medium exchange by a spin desalting column takes only about 10 min in contrast to an overnight length of time required for lyophilization, and that the use of spin desalting columns has made it possible to monitor the H/D-exchange behavior of a fully unfolded protein in a concentrated denaturant. We report the results of unfolded ubiquitin in 6.0M guanidinium chloride.

 

ジメチルスルホキシド(DMSO)クエンチされた水素/ジュウテリウム(H/D)-交換はタンパク質とタンパク質アセンブリのH/D-交換反応を特徴づける強力な方法である、そして、それは開いた国で非保護された速い交換アミド陽子を調査することに潜在的に役立つ。
しかしながら、方法が高い塩濃度で濃縮変性剤またはタンパク質溶液で完全には開いたタンパク質の研究のために使われなかった。
非常にはるかに報告されるタンパク質の現在のDMSOを急冷されたH/D-交換研究の全てにおいて、凍結乾燥はタンパク質溶液からD2 Oを削除するのに用いられた、そして、凍結乾燥されたタンパク質はH/D交換反応を消光して、アミド陽子信号を二次元の核磁気共鳴(2D NMR)範囲で測定するためにDMSO溶液に溶かされた。
このように凍結乾燥の後残っている変性剤または塩類は、良好なNMR範囲の測定を妨げる。
本論文では、我々は、柱を脱塩している回転の使用がD2 OバッファからDMSO溶液への中程度の交換のための凍結乾燥の非常に有効な代替物であると報告する。
回転脱塩柱による中程度の交換に凍結乾燥のために必要とされる一晩の時間と対照的にわずか約10分がかかる、そして、柱を脱塩している回転の使用が濃縮変性剤で完全に開いたタンパク質のH/D-交換性質をモニターすることを可能にしたことを、我々は示す。
我々は、塩化6.0Mのグアニジウムで、開いたユビキチンの結果を報告する。


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