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Chemical and Stereochemical Actions of UDP-Galactose 4-Epimerase.

Published date 2013 Jan 23

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Chemical and Stereochemical Actions of UDP-Galactose 4-Epimerase.

ウリジン二燐酸ガラクトース4‐エピメラーゼの化学および立体化学的動作。

Published date

2013-1-23

Journal

Acc Chem Res. 2013;

Author

Perry A Frey, Adrian D Hegeman

Affiliation

Department of Biochemistry, University of Wisconsin-Madison , 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, United States.

Abstract

Uridine(5')diphospho(1)α-d-galactose (UDP-gal) provides all galactosyl units in biologically synthesized carbohydrates. All healthy cells produce UDP-gal from uridine(5')diphospho(1)α-d-glucose (UDP-glc) by the action of UDP-galactose 4-epimerase (GalE). This Account provides our recent results describing unusual mechanistic features of this enzyme. Fully active GalE is dimeric and contains one tightly bound nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) per subunit. The NAD undergoes reversible reduction to NADH in the chemical mechanism. GalE displays unusual enzymological, chemical, and stereochemical properties. These include practically irreversible binding of NAD, nonstereospecific hydride transfer, uridine nucleotide-induced activation of NAD, Tyr149 as a base catalyst, and [GalE-NADH]-oxidation in one-electron steps by one-electron acceptors. Early studies revealed that uridine(5')diphospho(1)α-d-4-ketopyranose (UDP-4-ketopyranose) and NADH are reaction intermediates. Weak binding of the 4-ketopyranosyl moiety and strong binding of the UDP-moiety allowed either face of the 4-ketopyranosyl moiety to accept hydride from NADH. In crystal structures of GalE, NAD bound within a Rossmann-type fold and uridine nucleotides within a substrate domain. Structures of [GalE-NADH] in complex with UDP-glc show Lys153, Tyr149, and Ser124 in contact with NAD or glucosyl-C4(OH). Lys153 forms hydrogen bonds to the ribosyl-OH groups of NAD. The phenolate of Tyr149 is associated with both the nicotinamide ring of NAD and glucosyl-C4(OH). Ser124 is hydrogen-bonded to glucosyl-C4(OH). Spectrophotometry studies show a pH-dependent charge transfer (CT) complex between Tyr149 and NAD. The CT-complex has a pK(a) of 6.1, which results in bleaching of the CT-band. The CT-band also bleaches upon binding of a uridine nucleotide. Kinetic experiments with wild-type GalE and Ser124Ala-GalE show the same kinetic pK(a) values as the corresponding CT-band pK(a), which point to Tyr149 as the base catalyst for hydride transfer. We used NMR studies to verify that uridine nucleotide binding polarizes nicotinamide π-electrons. The binding of uridine(5')-diphosphate (UDP) to GalE-[nicotinamide-1-(15)N]NAD shifts the (15)N-signal upfield 3 ppm, whereas UDP-binding to GalE-[nicotinamide-4-(13)C]NAD shifts the (13)C-signal downfield by 3.4 ppm. Electrochemical and (13)C NMR data for a series of N-alkylnicotinamides show that the 3.4 ppm downfield (13)C-perturbation in GalE corresponds to an elevation of the NAD reduction potential by 150 mV. These results account for the uridine nucleotide-dependence in the reduction of [GalE-NAD] by glucose or NaBH(3)CN. Kinetics in the reduction of Tyr149Phe- and Lys153Met-GalE-NAD implicate Tyr149 and Lys153 in the nucleotide-dependent reduction of NAD. They further implicate electrostatic repulsion between N1 of NAD and the ε-aminium group of Lys153 in nucleotide-induced activation of NAD. In an O(2)-dependent reaction, [GalE-NADH] reduces the stable radical UDP-TEMPO with production of superoxide radical. The reaction must proceed by way of a NAD-pyridinyl radical intermediate.

 

ウリジン(5』)diphospho(1)α-d-ガラクトース(UDP-ガロン)は、生物学的に合成された炭水化物ですべてのガラクトシル単位を提供する。
すべての健康な細胞は、ウリジン二燐酸ガラクトース4‐エピメラーゼ(GalE)の動作によって、UDP-ガロンをウリジン(5』)diphospho(1)α-d-ブドウ糖(UDP-glc)から作り出す。
このAccountは、この酵素の変わった機械学の特徴を述べている我々の最近の結果を提供する。
完全に活発なGalEは二量体で、サブユニット当たり1つのきつく縛られたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)を含む。
NADは、化学機序でNADHへの可逆縮小を受ける。
GalEは、変わった酵素学的な、化学および立体化学的特性を示す。
これらは、1-電子受容体によってNAD、非立体特異的な水素化物転送、NADのウリジンヌクレオチドによって誘発された活性化、塩基触媒としてのTyr149と[GalE-NADH]-酸化のほとんど不可逆的な結合を1-電子ステップに含む。
初期試験で、ウリジン(5』)diphospho(1)α-d-4-ケトピラノース(UDP-4-ケトピラノース)とNADHが反応中間体であることが分かった。
4-ketopyranosyl部分の弱い結合とUDP-部分の強い結合は、4-ketopyranosyl機能基のいずれの表面もNADHから水素化物を受け入れさせた。
GalEの結晶構造において、NADは基質領域の中でロスマン-型ひだとウリジンヌクレオチドの中で結合した。
構造、UDP-glcによる総合ビルでは、NADまたはグルコシルC4(OH)と接触があるLys153、Tyr149とSer124は、見える[強風-NADH]。
Lys153は、NADのリボシル-OH群に、水素結合を築く。
Tyr149のフェノラートは、NADのニコチンアミド環とグルコシルC4(OH)と関係している。
Ser124は、グルコシルC4(OH)に、水素接着である。
分光光度法研究は、Tyr149とNADの間にpH依存的な電荷移動(CT)複合体を示す。
CT-複合体は6.1のpK(a)を持つ。
そして、それはCT-バンドの脱色に帰着する。
CT-バンドも、ウリジンヌクレオチドを結合すると、即座に、白くなる。
野生型GalEとSer124Ala-GalEによる速度実験は対応するCT-バンドpK(a)と同じ動力学的pK(a)値を示す。
そして、それは水素化物転送のための塩基触媒としてTyr149を示している。
我々は、ウリジン・ヌクレオチド結合がニコチンアミドπ-電子を分極化させることを確かめるために、NMR研究を使用した。
ウリジン(5』)-二リン酸塩(UDP)をGalE-[ニコチンアミド-1-(15)N]NADに結合することは攻撃陣内へ(15)N-信号を3ppm移すが、GalE-[ニコチンアミド-4-(13)C]NADに対するUDP-結合は3.4ppm (13)C-信号ダウンフィールドを移す。
電気化学的および(13)一連のN-アルキルニコチンアミドのためのC NMRデータは、それに3.4ppmのダウンフィールドを示す、GalEの(13)C-混乱が、150mV NAD還元電位の上昇に対応する。
これらの結果は、[GalE-NAD]そばにブドウ糖またはNaBH(3)CNの減少に対するウリジンヌクレオチド-信頼を説明する。
Tyr149Phe-とLys153Met-強風-NADの減少の動力学は、Tyr149とLys153をNADのヌクレオチド依存的な減少に関係させる。
彼らは、NADのN1とNADのヌクレオチドによって誘発された活性化のLys153のε-aminium群の間に静電反発を更に関係させる。
(2)-依存的なOにおいて、反応はスーパーオキシドラジカルの産生で、安定根治的UDP-TEMPOを低下させる[GalE-NADH]。
反応は、中間のNAD-ピリジニル基として進行しなければならない。


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