[Construction of epithelia membrane protein 1 gene-deficient in human fetal nucleus pulposus cell model by lentivirus -mediated RNA interference].
［レンチウイルスによるヒト胎児の髄核細胞モデルで遺伝子が不足している上皮膜蛋白質1の構造は- RNA干渉を媒介した］。
Zhongguo Gu Shang. 2012; 25; 842-5;
Department of Orthopaedics, 309th Hospital of PLA, Beijing, China. huming309@hotmail.com
Abstract
OBJECTIVE: To construct Epithelia Membrane Protein 1 gene-deficient in human fetal nucleus pulposus model by lentivirus-mediated RNA interference for building a platform for illustrating the biomechanisms role of EMP-1 during human intervertebral disc degeneration.
METHODS: The lentivirus vector with shRNA targeting EMP-1 mRNA was transected into 293FT cells by liposome. Then the lentivirus supernatant was obtained and used for infecting human fetal nucleus pulposus. The expression of GFP was observed under fluorescence microscope after 48 h. The viral particles were collected at 72 h after transfection. The efficacy of gene interference was tested by Western blot and Real-time RT-PCR. Analysis the results of the fluorescent microscope scenes and get the average values of EMP-1/GAPDH by detected the interference efficiency of various interference DNA sequences with western blot and semi quantitative RT-PCR methods.
RESULTS: The lentivirns with high titer were obtained and the EMP-1 gene deficient cell strains were obtained. Semi quantitative RT-PCR and Western blot proved the average values of EMP-1/GAPDH decreased from 0.46 to 0.32 and 0.5 to 0.25 (P < 0.01).
CONCLUSION: Lentivirus packaging technology can be mastered skillfully. EMP-1 gene-deficient cell models are successfully established.
方法shRNAターゲッティングEMP-1 mRNAによるレンチウイルス媒体動物は、リポソームによって293FT細胞に横に切断された。
それから、レンチウイルス上澄みが、ヒトの胎児の髄核を汚染するために得られて、使われた。
GFPの発現は、48時間後に蛍光顕微鏡の下で観察された。
ウイルス粒子は、トランスフェクションの後72時間に集められた。
遺伝子干渉の有効性は、ウエスタンブロットとReal回のRT-PCRによって試験された。
分析蛍光顕微鏡シーンの結果、そして、EMP-1/GAPDHの平均値をする、ウエスタンブロットによるさまざまな干渉DNA配列の干渉効率と準決勝定量的RT-PCR方法は、検出した。
結果高い力価によるlentivirnsは採取された、そして、不十分な細胞がこすEMP-1遺伝子は得られた。
準決勝定量的RT-PCRとウエスタンブロットは、EMP-1/GAPDHの平均値が0.46から0.32と0.5～0.25に（P < 0.01）減少するということを証明した。
結論レンチウイルス包装技術は、巧みにマスターされることができる。
EMP-1遺伝子欠乏性細胞モデルは、うまく確立される。